如何使用CNVkit進行CNV分析

本篇內容主要講解“如何使用CNVkit進行CNV分析”，感興趣的朋友不妨來看看。本文介紹的方法操作簡單快捷，實用性強。下面就讓小編來帶大家學習“如何使用CNVkit進行CNV分析”吧!

CNVkit是一款CNV預測軟件，適用于全外顯子，目的區域靶向測序等數據的CNV檢測，官網如下

https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/

被很多高分文章引用， 示意如下

文章發表在PLos上，鏈接如下

https://journals.plos.org/ploscompbiol/article?id=10.1371/journal.pcbi.1004873

和Excavator類似，CNVKit也將基因組劃分為in-target和off-target兩部分，流程圖示意如下

將in-target和off-target區域劃分成小的bin區間，統計bin區間內的測序深度，綜合考慮GC含量，目的區域的大小和分布密度， 重復元件等因素，對原始測序深度進行校正，然后計算相對對照樣本的log2 ratio, 通過segmentation算法來劃分segment, 支持cbs, haar, flasso多種segmentation算法。

CNVkit采用python進行開發，使用方便，集成了可視化功能，可以直觀的展示分析結果，支持導出多種格式的結果文件，可以很好的與下游軟件相結合。采用了模塊化的開發思想，按照功能拆分成了獨立的模塊，示意如下

每個功能模塊對應一個子命令，為了方便調用，將pipeline的完整功能封裝在batch子命令中，只通過這一個命令來運行整個pipeline。整個數據分析的過程可以分為以下幾個部分

1.  輸入區域文件

對于靶向測序而言，肯定需要輸入目的區域的文件，格式為bed， target子命令用于處理目的區域的bed文件，可以添加對應的基因注釋等信息，用法如下

cnvkit.py target \
my_baits.bed \
--annotate refFlat.txt \
-o my_targets.bed

除了目的區域in-target，還需要計算off-set區域，也稱之為antitarget,  in-target和off-target區域加起來就是基因組上所有可覆蓋的區域。二測測序并不能達到100%的覆蓋度，基因組上的高重復區域，端粒，著絲粒等區域就無法覆蓋，所以cnvkit通過access子命令來計算基因組上可以覆蓋到的區域，命令如下

cnvkit.py access \
hg19.fa \
-x excludes.bed \
-o access.hg19.bed

計算出可覆蓋的區域之后，減去in-target區域， 就可以得到off-target區域，通過antitarget子命令來實現，代碼如下

cnvkit.py antitarget \
my_targets.bed \
-g access.hg19.bed \
-o my_antitargets.bed

2. 計算樣本的測序深度

coverage和autobin兩個子命令都可以用來計算測序深度，以coverage為例，用法如下

cnvkit.py coverage \
Sample.bam \
my_targets.bed \
-o Sample.targetcoverage.cnn

cnvkit.py coverage \
Sample.bam \
my_antitargets.bed \
-o Sample.antitargetcoverage.cnn

分別統計target和antitarget區域的測序深度信息，輸出結果后綴為cnn,是cnvkit中定義的一種格式，專門用來存儲測序深度信息。

3. 構建正常基因組的測序分布模型

通過reference子命令來構建正常基因組的測序分布模型，采用對照樣本的測序深度，校正GC含量等系統誤差。有多個對照樣本時，可以將所有的對照樣本合并來創建，用法如下

cnvkit.py reference \
*coverage.cnn \
-f hg19.fa \
-o Reference.cnn

當沒有對照樣本時，軟件可以模擬出一個正常的測序深度分布模型，用法如下

cnvkit.py reference \
-o FlatReference.cnn \
-f hg19.fa \
-t my_targets.bed \
-a my_antitargets.bed

4. 計算實驗樣本相對正常對照的log2 ratio

通過fix子命令計算log2 ratio，用法如下

cnvkit.py fix \
Sample.targetcoverage.cnn \
Sample.antitargetcoverage.cnn \
Reference.cnn \
-o Sample.cnr

輸出結果后綴為cnr, 是cnvkit中定義的一種格式，專門用來存儲log2ratio的信息。

5. 劃分segment, 計算拷貝數

通過segment子命令進行segment的劃分，用法如下

cnvkit.py segment \
Sample.cnr \
-o Sample.cns

輸出結果后綴為cns, 是cnvkit中定義的一種格式，和SEG格式類似，用來存儲CNV分析的結果。接下來還可以通過call子命令，計算每個segment區域的絕對拷貝數，用法如下

cnvkit.py call \
Sample.cns \
-o Sample.call.cns

關于各種文件格式的具體解釋可以參考以下鏈接

https://cnvkit.readthedocs.io/en/stable/fileformats.html

6. 結果可視化

提供了以下3種可視化的子命令

1. diagram

2. scatter

3. heatmap

   
   

diagram用于展示單個樣本的CNV在染色體上的分布，用法如下

cnvkit.py diagram \
-s Sample.cns \
Sample.cnr

可視化結果如下

scatter子命令展示單個樣本染色體區域上log2 ratio值的分布，用法如下

cnvkit.py scatter \
-s Sample.cns \
Sample.cnr

可視化結果示意如下

heatmap子命令展示多個樣本的CNV分布情況，用法如下

cnvkit.py heatmap *.cns

可視化結果示意如下

分布運行步驟繁瑣，上面的代碼可以通過batch一個子命令搞定，用法如下

cnvkit.py batch \
*Tumor.bam \
--normal *Normal.bam \
--targets my_baits.bed \
--annotate refFlat.txt \
--fasta hg19.fasta \
--access access.hg19.bed \
--output-reference my_reference.cnn \
--output-dir results/ \
--diagram --scatter

到此，相信大家對“如何使用CNVkit進行CNV分析”有了更深的了解，不妨來實際操作一番吧！這里是億速云網站，更多相關內容可以進入相關頻道進行查詢，關注我們，繼續學習！