怎么使用EXCAVATOR2檢測WES的CNV

怎么使用EXCAVATOR2檢測WES的CNV，針對這個問題，這篇文章詳細介紹了相對應的分析和解答，希望可以幫助更多想解決這個問題的小伙伴找到更簡單易行的方法。

excavator2是一款利用WES數據進行CNV分析的軟件，其他同類軟件通常只關注捕獲的exon區域，而該軟件則進行了延伸，將捕獲區域劃分為exon和非exon區域兩部分，在校正測序深度的分布時對這兩部分區域分別分別進行處理，對應的文章發表在Nucleic Acids Research上，鏈接如下

https://academic.oup.com/nar/article/44/20/e154/2607979

該軟件的源代碼保存在sourceforge上，鏈接如下

https://sourceforge.net/projects/excavator2tool/

excavator2在計算測序深度時將reads分為了以下兩個部分

1. in-target reads

2. off-target reads

   
   

in-target表示的是位于exon上的序列，off-target表示的是位于基因間區或者內含子區的序列，同樣采用了滑動窗口的方式來統計每個區域的測序深度，只不過稍作變化，全稱如下

mean windows read count

簡稱WMRC, 計算公式如下

單個外顯子直接作為一個窗口，而非外顯子區域則采用了一個固定長度的窗口，分開統計不同區域的測序深度，并進行校正，校正的時候考慮了GC含量，不同區域的mappability, 外顯子的大小等因素。

利用歸一化之后的測序深度，計算對照樣本和實驗樣本的log2 ratio值，然后采用HSLM segmentation算法劃分segment, 最后通過FastCall算法預測每個segment的拷貝數情況，細分為以下5種

1. two-copy deletion

2. one-copy deletion

3. normal

4. one-copy duplication

5. multiple-copy duplicaiton

   
   

該軟件支持hg19和hg38兩個版本，內置了對應的數據庫，示意如下

該軟件分成了3個模塊，對應3個腳本，具體操作步驟如下

1. TargetPerla.pl

提供一個捕獲區域的bed文件，計算in-target和off-target區域的GC含量，mappability值，用于后續的歸一化操作，用法如下

perl TargetPerla.pl \
SourceTarget.txt \
myTarget.bed \
MyTarget_w50000 \
50000 \
hg19

第一個參數為source target文件，該文件記錄了基因組對應的bw文件和fasta文件的路徑，內容示意如下

/data/ucsc.hg19.bw /data/hg19.fasta

空格分隔的兩列，第一列為bw文件的路徑，該文件是軟件自帶的，位于軟件的安裝目錄，用于計算基因組不同區域的mappability，第二列為fasta文件的路徑，用于計算不同區域的GC含量。

第二個參數為捕獲區域的bed文件，第三個參數為輸出結果的前綴，第四個參數為窗口的固定長度，第五個參數指定基因組的版本。

這一步類似于比對時建立參考基因組的索引，一個芯片建立一次即可，運行成功后，會生成一個文件夾，前綴為MyTarget_w50000。

2. EXCAVATORDataPrepare.pl

計算測序深度，進行歸一化處理，用法如下

perl EXCAVATORDataPrepare.pl \
ExperimentalFile.txt \
--processors 6 \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19

第一個參數是一個空格分隔的txt文件，指定了樣本對應的bam文件，輸出結果的路徑，樣本名稱信息，內容示意如下

--processors指定并行的線程數，--target參數指定第一步生成的target的名稱，--assembly指定參考基因組的版本。

3. EXCAVATORDataAnalysis.pl

執行HSLM segmentation算法和FastCall算法，進行CNV分析，用法如下

perl EXCAVATORDataAnalysis.pl \
ExperimentalFileAnalysis.txt \
--processors 6  \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19 \
--output Results_MyProject_w50K \
--mode pooling

--mode參數表示樣本如何進行比較，支持pooling和paired兩種模式，第一種模式將所有的實驗樣本混合與對照樣本進行比較，第二種模式則是配對樣本模式，比如癌和癌旁，兩兩之間進行比較，計算log2 ration值。

第一個參數ExperimentalFileAnalysis.txt是一個空格分隔的txt文件，指定了樣本的比較操作，對于pooling模式，其內容示意如下

對于paired模式，其內容示意如下

T表示Treat, C表示Control, 后面的數字用于區分不同樣本。

--output指定了輸出結果的目錄，輸出結果中提供了CNV區域對應的txt, VCF等文件，同時還提供了可視化的結果，示意如下

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