cutadapt如何去除adapter序列

這篇文章主要介紹cutadapt如何去除adapter序列，文中介紹的非常詳細，具有一定的參考價值，感興趣的小伙伴們一定要看完！

對于NGS數據分析而言，第一步都是進行質量控制，質量控制包括去除adapter序列，去除低質量序列等內容。在文庫構建階段，為了能夠上機測序，會在插入片段兩端添加adapter序列。當測序讀長超過了插入片段長度時，就會讀取到adapter序列。

adapter序列是人為引入的序列，而我們之關心插入片段的測序結果，所以首先要做的就是去除adapter序列。在去除adapter序列時，需要考慮以下兩個因素

1. 由于測序錯誤率的原因，測序得到的adapter序列會和原本的adapter序列存在幾個堿基的誤差，所以去除adapter序列時必須允許堿基的錯配

2. 由于插入片段的長度在一定范圍內變化，而adpter序列出現在兩端的位置，所以測序讀到的adapter序列可能只是原本adapter的部分序列

   
   

cutadapt 是一款對NGS數據進行質量過濾的軟件，無論是5’端adapter,還是3’端adapter, 都可以有效的去除，同時也可以過濾低質量，去除長度太短的序列。

這個軟件采用python開發，安裝方便，代碼如下

pip install cutadapt

1. 去除3’端引物序列

對于3’端序列，可能存在以下情況

綠色部分為adapter序列，灰色部分為軟件會去除掉的序列，可以看到，無論是只讀取到部分adapter序列還是完整的adapter序列，軟件都能夠有效的去除3’端adapter序列。

用法如下

cutadapt -a AACCGGTT -o output.fastq input.fastq

針對目前主流的雙端測序數據，adapter序列都是出現在3’端，R1序列的3’端可能出現3’adapter 序列，R2端序列的3’端會出現5’端adpter的反向互補序列，示意如下

需要注意的是，無論是R1端還是R2端，其5’端都不會出現adapter，因為測序反應是直接從插入片段開始的。對于雙端數據，只需要分別對R1和R2序列去除3’端adapter序列就可以了。

2. 去除5’端adapter序列

cutadapt 軟件也支持去除5’端adapter序列，雖然測序反應中不會出現5’adapter, 但是這里adapter的概念可以延伸一下，比如PCR引物序列。在某些測序策略中，首選需要用PCR反應擴增出目的片段，然后在建庫。如果想要去除插入片段5’端的PCR引物，這個用法就派上了用場。

對于5’端序列，可能存在以下情況

綠色部分為adapter序列，灰色部分為軟件會去除掉的序列，前兩種格式和，無論是只讀取到部分adapter序列還是完整的adapter序列，軟件都能夠有效的去除5’端adapter序列。

用法如下

cutadapt -g AACCGGTT -o output.fastq input.fastq

在查找adapter序列時，cutadapt還提供了Anchored模式，在該模式下，必須查找到完整的adapter序列后，才會進行切除工作。

3’端Anchored模式寫法如下

cutadapt -a AACCGGTT$ -o output.fastq input.fastq

5’端Anchored模式寫法如下

cutadapt -g ^AACCGGTT -o output.fastq input.fastq

cutadapt在查找adapter時， 有以下兩種默認行為

1. 默認允許錯配和插入缺失

假設adapter 序列是ADAPTER, 此時對于以下3種情況

ADABTER    有一個錯配，
ADAPTR      有一個缺失
ADAPPTER  有一個插入

cutadapt 都認為是adapter序列，然后進行去除。可以采用-e參數 指定錯配的比例， 默認-e 為0.1， 比如adapter序列長度為21，允許的錯配數為 21 * 0.1 = 2.1, 然后直接向下取整后為2， 所以允許的錯配數為2；可以采用-no-indels參數來禁止插入和缺失。

2. 默認允許部分匹配

cutadapt默認允許部分匹配，比如 adapter 序列為ADAPTER, 測序得到的序列為ATCGATGCTADCGAGCGC,在序列中間位置的AD是adapter 序列的一部分， 此時會把AD以及之后的序列全部剪切掉，這種情況屬于錯誤的判別。為了防止此類錯誤判別的出現，cutadapt 默認必須至少有3個堿基匹配時才會認為是adapter 序列，然后進行切除， 這個閾值可以通過 --overlap 參數來指定。

cutdadapt還支持根據質量進行過濾,用法如下

cutadapt -q 10 -o output.fastq input.fastq

低質量序列通常出現在reads的3’端，上述寫法表示對3’端低質量堿基進行過濾，質量的閾值為10，具體計算過程如下，假設一段序列質量編碼為

42, 40, 26, 27, 8, 7, 11, 4, 2, 3

質量過濾的閾值-q為10，則首先減去10

32, 30, 16, 17, -2, -3, 1, -6, -8, -7

然后從從末端開始累加，得到如下數值

(70), (38), 8, -8, -25, -23, -20, -21, -15, -7

-25 最小，所以保留-25 之前的堿基， 即保留前4位堿基,后續堿基認為是低質量堿基，直接切除掉。

cutadapt 也可以根據長度對序列進行過濾，-m參數指定序列的最小長度，低于該長度的序列會被過濾掉，-M參數指定序列的最大長度，大于該長度的序列會被過濾掉。

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