stringTie工具有什么用

這篇文章主要介紹stringTie工具有什么用，文中介紹的非常詳細，具有一定的參考價值，感興趣的小伙伴們一定要看完！

對于轉錄組數據而言，最基礎的分析就是基因和轉錄本水平的定量了，定量就是確定一個基因或者轉錄本的表達量，其中定量的方式有很多種。

最直接的方式就是統計mapping到這個基因/轉錄本上的reads的個數，將reads數作為表達量。我們稱這種表達量為raw count。

在raw count的基礎上，利用外顯子長度進行歸一化，就得到了TPM值的定量方式。對于每個基因，將raw count除了該基因的長度（exon長度之和) , 得到長度歸一化之后的表達量。某個基因的TPM值就是利用歸一化之后的表達量，計算了一個相對豐度。具體計算公式如下，注意基因長度以k為單位

在raw count的基礎上，利用測序量和外顯子長度兩個因素進行歸一化，就得到了RPKM/FPKM值的定量方式。首先將raw  count除了mapping 上的所有reads數，得到相對豐度，在除以該基因長度（exon長度之和）, 就可以計算出RPKM值。測試時每一條插入片段稱為一個fragment, 對于雙端測序，一個fragment 會得到兩條reads。

RPKM和FPKM 唯一不同的地方在于raw count的計算，RPKM 計算的是reads 數，而FPKM 值計算的是fragments 數，對于單端測序， fragment 和 reads 的個數是相等的；對于雙端測序，reads 數目是fragments 數目的兩倍，對于FPKM 而言，即使雙端的兩條reads都比對上了基因組，在計數時也知計一次，因為兩條reads來源于同一個fragment。

具體計算公式如下, 需要注意單位，mapping上的reads 總數以M為單位，基因長度以k為單位。

能夠進行定量的軟件有很多，本文主要介紹stringTie這款軟件。

在早期的轉錄組數據分析中，最經典的分析策略是tophat+cufflinks+cuffdiff, 這套分析的pipeline會給出基于FPKM值的定量結果，然后進行差異分析,但是隨著測序數據量的提高和分析手段的發展，這套分析策略出現了很多的問題。

首先就是tophat的速度很慢，相比新出的比對軟件，其速度可以算得上是龜速了，同樣的數據量，hisat/star只需要半個小時就可以比對完成，tophat2至少需要5到6個小時；其次，基于FPKM值得到的差異結果和實驗手段如qPCR驗證的一致性較差。

為了順應測序和分析的新趨勢，原本的開發團隊對整個pipeline進行了全面升級, 用hisat 代替tophat, 用stringTie + ballgown 代替cufflinks + cuffdiff。

stringTie 可以看做是cufflinks 軟件的升級版本，其功能和cufflinks是一樣的 ，包括下面兩個主要功能

1. 轉錄本組裝

2. 定量

   
   

相比cuffinks, 其運行速度更快。該軟件的官網如下

https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml

stringTie的輸入文件為經過排序之后的bam文件，常見用法有以下幾種

1. 對已知轉錄本進行定量

對于模式生物，如human, mouse等，通常只需要對已知的轉錄本定量即可，用法如下

stringtie -p 10 \
-G hg19.gtf \
-o output.gtf  \
-b ballgown_out_dir -e \
align.sorted.bam

-G參數指定參考基因組的gtf文件，-o指定輸出的文件，格式也為gtf, -b指定ballgown的輸出結果目錄，這個參數是為了方便下游進行ballgown差異分析，-e參數要求軟件只輸出已知轉錄本的定量結果。

在輸出的GTF格式的文件中，對于每個轉錄本，會給出以下3種表達量

1. coverage

2. TPM

3. FPKM

2.  組裝本組裝

對于單個樣本進行組裝，用法如下

stringtie align.sorted.bam
-o assembly.gtf
-p 20
-G hg19.gtf

在組裝的轉錄本中，也會給出定量的結果，對于組裝的新轉錄本和基因，默認采用STRG加數字編號進行區分，示例如下

gene_id "STRG.1"
transcript_id "STRG.1.1"

單個樣本組裝完成后，會合并所有樣本的轉錄本組裝結果，得到一個非冗余的轉錄本集合，用法如下

stringtie --merge \
-o assembly.gtf \
-p 20 \
-G hg19.gtf \
sampleA.gtf sampleB.gtf

在合并的非冗余轉錄本中，采用MSTRG加數字編號對基因和轉錄本進行編號，示例如下

gene_id "MSTRG.2"
transcript_id "MSTRG.2.2"

本質上，stringTie只提供了轉錄本水平的表達量，定量方式包括TPM和FPKM值兩種。為了進行raw count的定量方式，官方提供了prepED.py腳本，可以計算出raw count的表達量，用法如下

python prepDE.py \
-i sample_list.txt  \
-g gene_count_matrix.csv  \
-o transcript_count_matrix.csv

輸入文件為sample_list.txt， 該文件為\t分隔的兩列，第一列為樣本名稱，第二列為定量的gtf文件的路徑，示例如下

sampleA A.stringtie.gtf
sampleB B.stringtie.gtf

同時輸出基因和轉錄本水平的raw count表達量值。

采用stringTie進行定量，運行速度快是一個優勢，同時提供raw count, FPKM, TPM 3種定量方式的結果，也是其最便利的地方。

以上是“stringTie工具有什么用”這篇文章的所有內容，感謝各位的閱讀！希望分享的內容對大家有幫助，更多相關知識，歡迎關注億速云行業資訊頻道！